环状RNA（circRNA）是一类非编码RNA，由非规范的反向剪接事件产生，在中枢神经系统（CNS）中高表达，大量研究表明其参与多种病理和生理过程。
2024年4月，东南大学姚红红教授团队在《药学学报B》（IF=14.5）杂志上发表了题为《CircHECW2调控Gng4 mRNA N6-甲基腺苷酸甲基化参与星形胶质细胞功能障碍》的文章。在这篇文章中，作者发现重度抑郁障碍（MDD）患者血浆和慢性不可预测应激（CUS）小鼠模型中环状RNA HECW2（circHECW2）水平显著升高。值得注意的是，下调circHECW2可以减轻星形胶质细胞功能障碍和CUS引起的抑郁样行为。此外，进一步证明了下调circHECW2增加了甲基转移酶WTAP的表达，从而通过m导致Gng4表达增加。6修改，为 circHECW2 和 m 之间的相关性提供了功能见解6甲基化。这表明 circHECW2 可能成为治疗 MDD 的潜在靶点。
circHECW2 在 CUS 小鼠和 MDD 患者中上调
值得注意的是，LPS 和 CUS 诱导的 抑郁症模型在相关研究中有充分的记录 沮丧。 作者的 先前的研究首先证明 LPS 海马中的 circHECW2 水平升高 治疗 老鼠。 因此，为了调查 circHECW2 与抑郁症 (图 1C 和 D), 作者 分离海马体并 收集 CUS 小鼠的血浆。 接下来，作者检测了MDD患者和健康对照者（HC）血浆中circHECW2的水平，发现MDD患者血浆中circHECW2水平显著升高（图1E）。 值得注意的是，我们的分析显示，circHECW2 水平与汉密尔顿抑郁量表 24 项 (HAMD-24) 的评分 (图 1F)、蒙哥马利-阿斯伯格抑郁量表 (MADRS) 的评分 (图 1G) 以及汉密尔顿焦虑量表 (HAMA) 的评分 (图 1H) 呈正相关。 此外，通过线性回归分析，作者发现，circHECW2 表达水平升高且童年创伤问卷（CTQ）得分较高的 MDD 患者表现出更严重的抑郁症状（图 1J）。 为了评估 circHECW2 水平对 MDD 结果的预测能力，作者检查了 MDD 患者血浆中治疗两周后 circHECW2 水平的变化，发现 MDD 患者血浆中 circHECW2 水平在治疗 2 周后下降（图 1K）。
circHECW2 的下调可改善 CUS 引起的行为
微注射2周后，作者检查慢病毒转导的效果，发现在注射shRNA-circHECW2的小鼠中circHECW2的表达降低（图2C）。 行为测试包括蔗糖偏好测试 (SPT)、强迫游泳测试 (FST) 和悬尾测试 (TST)，用于评估 circHECW2 的效果。接受 CUS 治疗的小鼠的蔗糖偏好降低，表明快感缺乏。令人鼓舞的是，这种缺陷通过下调 circHECW2 表达得到显著缓解（图 2D）。 在 FST 和 TST 中，CUS 小鼠的不动时间明显延长，而注射 shRNA-circHECW2 的小鼠的这些影响得到明显改善（图 2E 和 F）。
circHECW2 在 CUS 小鼠海马星形胶质细胞功能障碍中的作用
随后，作者研究了circHECW2影响CUS后功能恢复的细胞机制。 为了进一步评估 circHECW2 表达上调的细胞类型，作者检测了 CUS 小鼠脑中的星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元和内皮细胞中 circHECW2 的表达（图 3A）。 结果显示，与小胶质细胞、神经元或内皮细胞衍生的 circHECW2 相比，CUS 中星形胶质细胞衍生的 circHECW2 显著上调（图 3B）。此外，荧光原位杂交染色表明 circHECW2 在星形胶质细胞中含量丰富（图 3C）。 此外，shRNA-circHECW2 治疗显著缓解了 CUS 小鼠中观察到的 GFAP 表达下降（图 3D 和 E）。然后，作者检测了 shRNA-circHECW2 对星形胶质细胞的功能’使用 GFAP 和 3D 重建的形态（图 3F）。 Sholl 分析表明，CUS 会导致星形胶质细胞功能障碍，其证据是星形胶质细胞的分支数量、长度和体积减少。 重要的是，这些缺陷通过 shRNA-circHECW2 治疗得到明显改善（图 3GeI）。综上所述，这些结果表明，星形胶质细胞中 circHECW2 的异常上调可能代表抑郁症进展中的一个关键分子事件。
circHECW2 抑制 m6通过下调 WTAP 实现甲基化
鉴于 m 的潜在作用6MDD中的A甲基化及circRNA与m的相互调控6甲基化，我们开始研究确定 circRNA’m6A 修饰在抑郁症病理过程中起着调节作用，特别是在星形胶质细胞介导的机制中。 CUS 导致海马中 m6A 水平下降，而 shRNAcircHECW2 可显著缓解这一影响，表明 circHECW2 对 m 具有调节作用6甲基化（图 4A）。 我们接下来测量了 CUS 小鼠模型中上述 m6A 修饰酶的 mRNA 和蛋白质水平的表达，发现 CUS 小鼠海马中只有 WTAP 的蛋白质水平降低了（图 4B）。 随后，我们使用转导 shRNA-circHECW2 慢病毒或 circHECW2 过表达质粒的小鼠原代星形胶质细胞进行进一步研究（图 4C 和 D）。 shRNA-circHECW2 处理的细胞中 WTAP 的表达显著增加（图 4E），而 Western blot 分析表明 circHECW2 不会改变 METTL3、METTL14、FTO 和 ALKBH5 的水平，表明 circHECW2 与 WTAP 之间存在特定关联。 为了证实这些发现，用 circHECW2 circHECW2 过表达质粒转导原代星形胶质细胞，发现星形胶质细胞中的 WTAP 显著减少（图 4F）。 接下来，采用pulldown分析探究circHECW2与WTAP的相互作用，发现circHECW2对WTAP表现出更强的亲和力（图4G）。 此外，体内实验表明，shRNA-circHECW2 显着改善了 CUS 模型诱导的 WTAP 表达（图 4H）。为了探究 CUS 后 WTAP 减少的原因，我们采用免疫沉淀法检测泛素化。在 CUS 模型中，circHECW2 敲低显著降低了 WTAP 的赖氨酸 48 连接泛素化 (Ub-K48) 水平（图 4I）。
接下来，我们研究了 circHECW2 和 WTAP 对星形胶质细胞存活的影响。 皮质酮用于体外模拟抑郁症。用 shRNAcircHECW2 转导的星形胶质细胞显示出皮质酮引起的活力下降有所改善（图 4J）。 相反，敲低WTAP表达则显著加剧皮质酮处理的星形胶质细胞活力下降（图4K）。此外，WTAP siRNA降低的星形胶质细胞活力可通过shRNA-circHECW2得到改善，进一步表明circHECW2与WTAP之间存在密切关系（图4L）。 此外，我们构建了脑星形胶质细胞特异性 AAVGFAP-WATP 敲低 (KD) 病毒。在海马中微注射 AAV-GFAP-WATP KD 和 shRNAcircHECW2 慢病毒三周后，对小鼠进行 CUS 或对照。在 CUS 暴露 4 周后检查包括 SPT、FST 和 TST 在内的行为实验。
WTAP 调节 m6抑郁症中的 Gng4 mRNA 修饰
为了寻找参与 CUS 小鼠的潜在下游分子，作者发表了一项转录组范围的 m6先前研究中对 CUS 小鼠海马的修改。基因本体生物过程 (GO-BP) 分析表明，下调的基因在与细胞过程相关的基因方面富集。 改变mRNA的区域6A 修改（下调基因）（图 5B）。 接下来，在 CUS 小鼠模型的海马中进行 RNA-seq 分析。我们鉴定出 288 个在 RNA-seq 分析中存在差异表达的基因（Cuffdiff 校正 P 值<0.05)（图 5C）。 特别有趣的是，两次比较之间有 19 个重叠的转录本（图 5D），这表明这些基因可能是涉及 CUS 后星形胶质细胞功能障碍的靶基因。 值得注意的是，这 19 个重叠转录本在 mRNA 水平上得到了验证。在 4 个上调转录本中，没有基因得到验证。 此外，MDD患者血浆中的GNG4含量显著降低，且GNG4与HAMD认知障碍评分呈负相关。 根据这些发现，GNG4 成为我们研究 MDD 的中心焦点。 此外，我们分析了涉及 GNG4 的通路及其与 m 降低的关联6京都基因与基因组百科全书（KEGG）的修改（图 5E）。 接下来，进一步的结果表明，Gng4 mRNA 30-UTR 中的峰区域（chr13：13825437e13825707）的 m6A 修饰减少（图 5F 和 G）。 作者采用荧光素酶测定法比较了野生型 (WT) 和突变型 m6有和没有 WTAP siRNA 处理的位点。 这些检测表明，突变可防止甲基化并增加 Gng4 mRNA 的稳定性（图 5H）。正如预期的那样，Gng4 的过度表达显著改善了皮质酮治疗后星形胶质细胞活力的下降（图 5I）。
CircHECW2 通过 WTAP 调节 Gng4 mRNA 的 m6A 甲基化
此外，作者研究了 GNG4 在 CUS 小鼠模型中的表达和功能。 CUS 小鼠海马中 Gng4 的 mRNA 和蛋白质水平显著降低，这与 Gng4 的 m6A 修饰降低一致（图 6A 和 B）。 此外，为了了解 Gng4 水平与 WTAP 之间的关系，将 WTAP siRNA 转染到小鼠原代星形胶质细胞中。 GNG4和Gng4 mRNA的表达均降低（图6C）。 此外，circHECW2 的上调导致 Gng4 的 mRNA 和蛋白质水平降低（图 6D）。相反，星形胶质细胞中 circHECW2 的下调会增加 Gng4 的 mRNA 和蛋白质水平（图 6E）。 WTAP siRNA 和 shRNAcircHECW2 共转染表明，WTAP siRNA 降低了 GNG4 水平，而 shRNA-circHECW2 明显改善了这种状况（图 6F）。 为了验证这些体外发现，进行了蛋白质印迹分析以评估 shRNA-circHECW2 治疗的 CUS 小鼠中 GNG4 的水平。 结果表明 shRNA-circHECW2 治疗显著减轻了 CUS 小鼠中观察到的 GNG4 表达的降低（图 6G 和 H）。 我们还构建了脑星形胶质细胞特异性 AAV-GFAP-Gng4 KD 病毒。 海马微注射AAV-GFAP-Gng4 KD和shRNA-circHECW2慢病毒3周后，小鼠接受CUS或对照组，SPT、FSF、TST结果显示星形胶质细胞Gng4参与调控抑郁症中的circHECW2（图6IeK）。
在 MDD 患者中，海马与前额皮质的功能连接与 GNG4 呈正相关
最后，进行了种子到体素分析（海马功能连接），结果显示 MDD 患者的海马功能连接 (FC) 与前额叶皮质 (PFC) 之间存在联系。如图 7A-C 所示，与 HC 相比，MDD 患者的海马和前额叶皮质之间的 FC 明显减少。 我们接下来发现海马体和背外侧前额叶皮质之间的静息状态功能连接（rsFC）显著下降（图 7D），而其他大脑区域，如视觉皮层和下颞叶，没有表现出显著差异。 此外，我们发现 GNG4 水平与 rsFC 之间存在正相关性，表明 GNG4 可能在 MDD 患者的认知大脑功能中发挥作用（图 7E）。
概括
我们的研究表明，circHECW2 的上调通过 WTAP 介导的 m6修饰，并导致随后的星形胶质细胞功能障碍。具体来说，circHECW2 促进了 CUS 小鼠模型中 WTAP 的泛素介导降解，而当 WTAP 在星形胶质细胞中下调时，GNG4 对维持正常星形胶质细胞功能的作用就会消失。 因此，circHECW2/WTAP/GNG4 轴通过 WTAP 介导的 m6A 修饰降低 GNG4 稳定性来调节星形胶质细胞功能障碍。 总之，我们的研究结果表明，circHECW2 有望成为治疗抑郁症的治疗靶点。此外，我们的研究还揭示了 circHECW2 与 m 之间的功能联系6甲基化为开发 MDD 的预防策略和有效治疗提供了新的见解。
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