环状RNA（circRNA）是一类非编码RNA，由非规范的反向剪接事件产生，在中枢神经系统（CNS）中高表达，大量研究表明其参与多种病理和生理过程。2024年4月，东南大学姚红红教授团队在《药学学报B》（IF=14.5）杂志上发表了题为《CircHECW2调控Gng4 mRNA N6-甲基腺苷酸甲基化参与星形胶质细胞功能障碍》的文章。在这篇文章中，作者发现重度抑郁障碍（MDD）患者血浆和慢性不可预测应激（CUS）小鼠模型中环状RNA HECW2（circHECW2）水平显著升高。值得注意的是，下调circHECW2可以减轻星形胶质细胞功能障碍和CUS引起的抑郁样行为。此外，进一步证明了下调circHECW2增加了甲基转移酶WTAP的表达，从而通过m导致Gng4表达增加。6修改，为 circHECW2 和 m 之间的相关性提供了功能见解6甲基化。这表明 circHECW2 可能成为治疗 MDD 的潜在靶点。circHECW2 在 CUS 小鼠和 MDD 患者中上调值得注意的是，LPS 和 CUS 诱导的 抑郁症模型在相关研究中有充分的记录 沮丧。 作者的 先前的研究首先证明 LPS 海马中的 circHECW2 水平升高 治疗 老鼠。 因此，为了调查 circHECW2 与抑郁症 (图 1C 和 D), 作者 分离海马体并 收集 CUS 小鼠的血浆。 接下来，作者检测了MDD患者和健康对照者（HC）血浆中circHECW2的水平，发现MDD患者血浆中circHECW2水平显著升高（图1E）。 值得注意的是，我们的分析显示，circHECW2 水平与汉密尔顿抑郁量表 24 项 (HAMD-24) 的评分 (图 1F)、蒙哥马利-阿斯伯格抑郁量表 (MADRS) 的评分 (图 1G) 以及汉密尔顿焦虑量表 (HAMA) 的评分 (图 1H) 呈正相关。 此外，通过线性回归分析，作者发现，circHECW2 表达水平升高且童年创伤问卷（CTQ）得分较高的 MDD 患者表现出更严重的抑郁症状（图 1J）。 为了评估 circHECW2 水平对 MDD 结果的预测能力，作者检查了 MDD 患者血浆中治疗两周后 circHECW2 水平的变化，发现 MDD 患者血浆中 circHECW2 水平在治疗 2 周后下降（图 1K）。circHECW2 的下调可改善 CUS 引起的行为微注射2周后，作者检查慢病毒转导的效果，发现在注射shRNA-circHECW2的小鼠中circHECW2的表达降低（图2C）。 行为测试包括蔗糖偏好测试 (SPT)、强迫游泳测试 (FST) 和悬尾测试 (TST)，用于评估 circHECW2 的效果。接受 CUS 治疗的小鼠的蔗糖偏好降低，表明快感缺乏。令人鼓舞的是，这种缺陷通过下调 circHECW2 表达得到显著缓解（图 2D）。 在 FST 和 TST 中，CUS 小鼠的不动时间明显延长，而注射 shRNA-circHECW2 的小鼠的这些影响得到明显改善（图 2E 和 F）。circHECW2 在 CUS 小鼠海马星形胶质细胞功能障碍中的作用随后，作者研究了circHECW2影响CUS后功能恢复的细胞机制。 为了进一步评估 circHECW2 表达上调的细胞类型，作者检测了 CUS 小鼠脑中的星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元和内皮细胞中 circHECW2 的表达（图 3A）。 结果显示，与小胶质细胞、神经元或内皮细胞衍生的 circHECW2 相比，CUS 中星形胶质细胞衍生的 circHECW2 显著上调（图 3B）。此外，荧光原位杂交染色表明 circHECW2 在星形胶质细胞中含量丰富（图 3C）。 此外，shRNA-circHECW2 治疗显著缓解了 CUS 小鼠中观察到的 GFAP 表达下降（图 3D 和 E）。然后，作者检测了 shRNA-circHECW2 对星形胶质细胞的功能’使用 GFAP 和 3D 重建的形态（图 3F）。 Sholl 分析表明，CUS 会导致星形胶质细胞功能障碍，其证据是星形胶质细胞的分支数量、长度和体积减少。 重要的是，这些缺陷通过 shRNA-circHECW2 治疗得到明显改善（图 3GeI）。综上所述，这些结果表明，星形胶质细胞中 circHECW2 的异常上调可能代表抑郁症进展中的一个关键分子事件。circHECW2 抑制 m6通过下调 WTAP 实现甲基化鉴于 m 的潜在作用6MDD中的A甲基化及circRNA与m的相互调控6甲基化，我们开始研究确定 circRNA’m6A 修饰在抑郁症病理过程中起着调节作用，特别是在星形胶质细胞介导的机制中。 CUS 导致海马中 m6A 水平下降，而 shRNAcircHECW2 可显著缓解这一影响，表明 circHECW2 对 m 具有调节作用6甲基化（图 4A）。 我们接下来测量了 CUS 小鼠模型中上述 m6A 修饰酶的 mRNA 和蛋白质水平的表达，发现 CUS 小鼠海马中只有 WTAP 的蛋白质水平降低了（图 4B）。 随后，我们使用转导 shRNA-circHECW2 慢病毒或 circHECW2 过表达质粒的小鼠原代星形胶质细胞进行进一步研究（图 4C 和 D）。 shRNA-circHECW2 处理的细胞中 WTAP 的表达显著增加（图 4E），而 Western blot 分析表明 circHECW2 不会改变 METTL3、METTL14、FTO 和 ALKBH5 的水平，表明 circHECW2 与 WTAP 之间存在特定关联。 为了证实这些发现，用 circHECW2 circHECW2 过表达质粒转导原代星形胶质细胞，发现星形胶质细胞中的 WTAP 显著减少（图 4F）。 接下来，采用pulldown分析探究circHECW2与WTAP的相互作用，发现circHECW2对WTAP表现出更强的亲和力（图4G）。 此外，体内实验表明，shRNA-circHECW2 显着改善了 CUS 模型诱导的 WTAP 表达（图 4H）。为了探究 CUS 后 WTAP 减少的原因，我们采用免疫沉淀法检测泛素化。在 CUS 模型中，circHECW2 敲低显著降低了 WTAP 的赖氨酸 48 连接泛素化 (Ub-K48) 水平（图 4I）。接下来，我们研究了 circHECW2 和 WTAP 对星形胶质细胞存活的影响。 皮质酮用于体外模拟抑郁症。用 shRNAcircHECW2 转导的星形胶质细胞显示出皮质酮引起的活力下降有所改善（图 4J）。 相反，敲低WTAP表达则显著加剧皮质酮处理的星形胶质细胞活力下降（图4K）。此外，WTAP siRNA降低的星形胶质细胞活力可通过shRNA-circHECW2得到改善，进一步表明circHECW2与WTAP之间存在密切关系（图4L）。 此外，我们构建了脑星形胶质细胞特异性 AAVGFAP-WATP 敲低 (KD) 病毒。在海马中微注射 AAV-GFAP-WATP KD 和 shRNAcircHECW2 慢病毒三周后，对小鼠进行 CUS 或对照。在 CUS 暴露 4 周后检查包括 SPT、FST 和 TST 在内的行为实验。WTAP 调节 m6抑郁症中的 Gng4 mRNA 修饰为了寻找参与 CUS 小鼠的潜在下游分子，作者发表了一项转录组范围的 m6先前研究中对 CUS 小鼠海马的修改。基因本体生物过程 (GO-BP) 分析表明，下调的基因在与细胞过程相关的基因方面富集。 改变mRNA的区域6A 修改（下调基因）（图 5B）。 接下来，在 CUS 小鼠模型的海马中进行 RNA-seq 分析。我们鉴定出 288 个在 RNA-seq 分析中存在差异表达的基因（Cuffdiff 校正 P 值

细胞外囊泡（EVs）是细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构（40-100nm），因其具有低免疫原性、可生物降解、低毒性、可穿过血脑屏障等优点，成为免疫治疗、再生医学等领域有前景的药物载体，并成为一种新型药物递送系统的载体。环状RNA DYM（circDYM）来源于DYM基因第4、5、6外显子，可以作为miRNA9的“海绵”，吸附、抑制miRNA，从而发挥调控作用。 2018年，东南大学医学院药理学系姚红红研究团队发现，海马区circDYM的过表达能够抑制miRNA 9的活性，最终降低小胶质细胞活化，减轻抑郁样行为。2022年1月13日，基于上述研究成果，姚红红研究团队构建了靶向中枢神经系统、包裹circDYM的胞外囊泡（RVG-circDYM-EVs），有效缓解了慢性应激导致的抑郁样行为障碍，成功将环状RNA开发成核酸药物。2011年，开发了一种利用外泌体靶向递送siRNA的新方法，将外泌体表面膜蛋白lamp2b与神经元特异性狂犬病毒糖蛋白（RVG）进行修饰融合，形成含有RVG-lamp2b融合蛋白的外泌体，通过电穿孔的方式，使外源短链干扰RNA进入外泌体，外泌体表面的RVG与乙酰胆碱受体结合，特异性地释放短链干扰RNA进入神经元，显著下调与阿尔茨海默病相关的蛋白BACE1的表达。通过类似的方法，研究人员构建了RVG-circDYM-EVs系统，利用外泌体作为载体，实现了靶向烟碱型乙酰胆碱受体的circDYM过表达（图1）。尾静脉注射200μg/ml 2小时后， μg RVG-circDYM-EVs后，该外泌体系统开始在小鼠肝脏、肾脏、心脏、脾脏、脑等部位富集（图2），其中肝脏的富集和表达最高。 随着时间的推移，外泌体的含量逐渐减少。此外，RVG-circDYM-EVs 可以特异性地表达在海马区的小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞上。这表明烟碱乙酰胆碱受体靶向过表达 circDYM 的外泌体可以穿透血脑屏障进入小鼠脑内，并均匀分布。体外细胞实验表明，RVG-circDYM-EVs 可以降低脂多糖诱导的小胶质细胞活化：iNOS、IL-6、IL-1 的表达β 和 MCP - 1 均降低。随后，尾静脉注射 100、200、300 和 400 μg RVG - circDYM - EVs 给患有因慢性压力引起的抑郁样行为的小鼠，200、300 和 400 μg剂量组能明显改善小鼠的抑郁样行为(图3)。为进一步探究RVG-circDYM-EVs调控小胶质细胞活性的分子机制，研究人员通过单细胞测序发现，转录因子TATA-box结合蛋白相关因子1（TAF1）蛋白能够调控10多个差异表达基因，并与circDYM相互作用，共定位于小胶质细胞胞浆中。体外实验显示，过表达TAF1促进Trpm6和Cyp39a1的表达，过表达circDYM则可抑制这种促进作用。脂多糖可以促进TAF1与Trpm6和Cyp39a1启动子结合，敲低Trpm6或Cyp39a1均可阻断脂多糖引起的iNOS水平升高，这些分子实验表明circDYM可以通过TAF1直接调控小胶质细胞的活化。慢性应激可导致海马区紧密连接蛋白表达减少，血脑屏障通透性增加，最终导致外周免疫细胞如CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞、B220阳性B细胞等向脑实质内浸润，RVG-circDYM-EVs治疗可部分修复血脑屏障，减少外周免疫细胞的浸润。据悉，该论文开发的RVG-circDYM-EVs已于2020年2月13日申请专利，申请名称为：针对烟碱型乙酰胆碱受体的外泌体-靶向过表达circDYM及其制备方法和应用。

“第七届circRNA研究与产业论坛”于2023年11月11-12日在广州成功举办！我们旨在提供一个交流平台，分享最新的circRNA研究成果，探讨前沿技术方法，促进circRNA在生物医药行业的发展和应用。过去几年，circRNA研究取得了令人瞩目的进展，揭示了其在基因表达和调控中的重要作用。如今，随着技术的进步和研究的深入，我们已经开始将circRNA作为疾病诊断的生物标志物，以及药物研发的新靶点。同时，通过将circRNA研究与人工智能等先进技术相结合，我们正在开启生物医学创新的新浪潮。在此背景下，我们特别策划了一场圆桌讨论，汇聚跨学科的顶尖专家和行业领袖，共同探讨circRNA未来的发展策略、技术挑战和转化机遇。我们坚信这样的对话与碰撞，不仅将推动circRNA的基础研究，也将加速其在医学、健康、生物技术等多个领域的实际应用。让我们走进这场圆桌讨论，聆听专家们的真知灼见，探索circRNA的无限可能。circRNA从基础研究到产业转化的高质量发展circRNA从基础研究到产业转化的高质量发展11日，东南大学首席教授姚红红、加拿大多伦多大学实验医学与病理学教授杨白华、中国科学技术大学生物科学与医学学院教授李向东、四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室教授彭勇就“circRNA从基础研究到产业转化的高质量发展”议题进行了讨论。 会议主要讨论了环状RNA在基础研究、应用及产业转化方面的问题。在基础研究方面，需要解决的关键问题包括蛋白表达的特异性、RNA结构的动态调控等；在应用方面，环状RNA可作为诊断标记物，有望成为微创或无创诊断的工具；在产业转化方面，需要解决递送、规模化生产等问题，未来或将出现环状RNA药物。环状RNA治疗的机遇与挑战12日，格赛生物CTO张茂磊先生、环码生物CTO杨云先生、原银生物CEO高鲁先生、友欢生物CEO戴东升先生、苏州大学青年特聘教授许聪聪先生等围绕“环状RNA治疗的机遇与挑战”这一话题展开了热烈而多维度的探讨。 会议主要讨论了环状RNA产业化前景、产业链构建、交付等关键问题，以及如何寻找重磅药物管线、推动临床进展等具体做法。与会老师认为，环状RNA产业化具有广阔的发展前景，但需要解决工艺层面的问题和产业链构建的瓶颈问题。建议加强产学研医合作，推动创新药物研发，解决循环难题，推动环状RNA治疗的发展和应用。 

基于 RNA 的疫苗是 COVID-19 疫情的英雄，创下了历史上最快的疫苗开发时间记录，从开发到获得 FDA 批准仅用了一年时间。最近，mRNA 技术获得了诺贝尔奖的认可，Katalin Kariko 和 Drew Weissman 因发现核苷碱基修饰而获得 2023 年诺贝尔生理学或医学奖，该修饰促成了针对 COVID-19 的有效 mRNA 疫苗的开发。人们早已认识到 RNA 技术存在一个关键的局限性：RNA 通常以线性结构存在，这导致这种形式的 mRNA 的寿命相对较短。几个小时内，细胞内核酸酶就会降解这些分子。虽然 RNA 的瞬时性质对疫苗来说不是问题，因为它只需要很短的时间来编码引发免疫反应的蛋白质，但它对大多数需要长期 RNA 稳定性的治疗应用构成了挑战。环状 RNA (circRNA) 具有共价闭合环结构，通过保护自身免受核酸酶降解，从而增强稳定性并延长其寿命，具有显着优势。从理论上讲，即使在低剂量水平下，环状 RNA 也可以增强治疗效果。 环状RNA的发现和发展环状RNA最早发现于1976年，但当时被认为是细胞内mRNA剪接错误的副产物。2013年，《自然》杂志同时发表了两篇关于环状RNA的研究论文，指出环状RNA是一种具有调控作用的非编码RNA，通过充当miRNA的海绵体来调控其他基因的表达。这使得沉寂了30多年的环状RNA引人注目，成为新一代明星分子，并被发现在细胞分化、组织稳态、疾病发展、免疫代谢等过程中发挥着重要的调控作用。 2018年7月，环状RNA发展史上的一个关键转折点，美国麻省理工学院（MIT）的Daniel Anderson等人在《自然通讯》杂志上发表论文，首次证明了人工改造的环状RNA可以在真核细胞中稳定高效地表达蛋白质。外源环状RNA在真核细胞中用于蛋白质表达的新应用，也证明了环状RNA是线性mRNA的有效替代品。  环状RNA创业热潮基于这项研究，丹尼尔·安德森创立了 Orna Therapeutics，这是世界上第一家利用环状 RNA 开发新疗法的公司。该公司的核心技术在于其 RNA 环化技术的开发，他们实现了超长环状 RNA 构建体，以环化编码肌营养不良蛋白的 12,000 个核苷酸长的 mRNA，而肌营养不良蛋白是杜氏肌营养不良症 (DMD) 所缺乏的。但 Orna 并不是唯一一家致力于环化技术的初创公司，还有其他公司采用不同的方法来构建环状 RNA。例如，Torque Bio 将制造环状 RNA 的说明放入病毒中，并在病毒细胞内进行拼接以制造环状 RNA。Chimera Therapeutics 使用基因工程细菌来生产环状 RNA。此外，还有两家来自中国的初创公司 Cyclocode Biology 和 Cremate，它们在去年以预印本形式发表的单独论文中开发了新的 RNA 环化技术。 环状RNA的优势及进展谈到环状RNA的优势，斯坦福大学的Howard Chang认为，只需一次注射就可以获得足够持久的蛋白质。2022年7月，张元浩团队在《自然·生物技术》杂志发表论文显示，通过多重优化设计，成功翻译环状RNA的蛋白质产量提高了数百倍，可以实现体内有效、持久的蛋白质生产。张锋与mRNA先驱、2023年诺贝尔生理学或医学奖获得者德鲁·魏斯曼（Drew Weissman）等人创立了一家名为Orbital Therapeutics的公司，该公司今年上半年完成了2.7亿美元的A轮融资。环状 RNA 技术的支持者预计它将成为制药行业首选的 RNA 平台，有可能开启下一代疫苗、罕见疾病治疗方法和抗癌药物。在开发环状RNA作为疗法时，我们需要去除环形成过程中的多余序列，以避免引起不必要的免疫反应。中国科学院分子与细胞科学卓越中心研究员陈玲玲表示，这实际上取决于环状RNA的具体构建方式。她的研究于2021年11月发表在《分子细胞》杂志上，表明在构建环状RNA时，自剪接基序留下的序列会扭曲RNA折叠，导致结构不规则的环状结构，从而引发免疫反应。然而，在某些情况下，免疫反应是可取的。2022 年 3 月，北京大学魏文胜教授领导的团队在《细胞》杂志上发表了一篇论文。这项研究在小鼠和猴子身上证明，与线性 mRNA 疫苗相比，环状 RNA 疫苗诱导了更多的中和抗体和更有效的 T 细胞反应。此外，环状 RNA 在环境温度下比线性 mRNA 更稳定，这意味着基于环状 RNA 的疫苗可以在不需要冷链的情况下储存和运输。魏文胜教授创立了 Cyranos Bio，并已开始对环状 RNA COVID-19 疫苗进行人体试验，这是合成环状 RNA 药物首次在人体中进行测试。2023 年，其他一些基于环状 RNA 的药物可能会进入临床试验，包括 CureVac 的一种癌症疗法，该疗法使用环状 RNA 编码免疫刺激分子白细胞介素-12（IL-12）。Orna 准备在 2024 年开始一项环状 RNA 疗法的临床试验。这种环状 RNA 疗法可以重新编程免疫细胞以攻击血癌。在今年 5 月的美国基因和细胞治疗学会 (ASGCT) 会议上，Orna 的科学家展示了临床前研究成果，表明向小鼠体内注射低剂量的 LNP 递送环状 RNA 可以原位重新编程 T 细胞并消除小鼠白血病模型中的肿瘤，而无需任何复杂的细胞工程或高强度的调理药物方案。合成的环状 RNA 不仅可以编码治疗性蛋白质。当它们折叠成特定形状时，这些环状 RNA 还可以直接与抗体等靶标结合，作为一种称为适体的药物。它们可以捕获和分离不同类型的调节分子，有效地将它们从细胞环境中移除。它们还可以充当“反义因子”与基因转录本 (mRNA) 结合，阻止或改变其表达。此外，它们还可以作为 RNA 编辑应用的引导分子，将特定酶引导到需要纠正的突变基因转录本上。各种初创公司都在积极探索这些应用。 人工智能促进环状RNA研究 2023年5月，百度美国研究院黄亮和张亮（现为中国药科大学教授）与科兴生物合作，在国际顶级学术期刊《自然》上发表论文，利用人工智能工具优化mRNA疫苗序列，从而帮助制造出更有效、更稳定的mRNA。这项研究不仅为 mRNA 疫苗提供了及时且有前景的工具，而且为 mRNA 疗法彻底改变医疗保健提供了巨大潜力。研究中开发的线性设计工具 LinearDesign 可优化编码所有治疗性蛋白质（包括单克隆抗体和抗癌药物）的 mRNA。 2023年7月，团队在预印本bioRxiv上发表论文，进一步开发了用于环状RNA结构预测和序列设计的circDesign算法平台。研究团队将circDesign算法应用于基于circRNA的狂犬病疫苗和带状疱疹疫苗的序列优化设计，增强了小鼠模型中circRNA的序列稳定性、蛋白翻译效率和免疫原性，成功验证了circDesign平台在circRNA序列设计优化中的有效性。 据悉，这是全球首例通过人工智能算法对环状RNA进行优化设计的案例，有望简化环状RNA的序列优化设计，提高效率、稳定性和蛋白质翻译水平。 circDesign算法和LinearDesign共同创始人、中国药科大学张良教授表示，与线性RNA相比，环状RNA的序列设计需要考虑的因素更多，目前团队正在积极探索不同RNA平台的设计算法，希望AI技术能加速RNA疫苗和药物的研发。环状RNA的问题环状RNA研究领域近年来取得了新的进展，但随着该领域的发展，一些问题也暴露出来。  今年6月，环状RNA领域获得资金最多的公司Laronde被曝数据造假，其核心研究项目使用环状RNA来表达减肥药GLP-1，该事件也引发了人们对环状RNA潜力的怀疑。开发基于合成生物学的 mRNA 疗法的公司 Strand Therapeutics 也开发了基于环状 RNA 的疗法，但该公司的联合创始人兼首席执行官 Jake Becraft 博士表示，环状 RNA 是垃圾！开发基于环状 RNA 的药物或疗法所涉及的挑战数量令人难以置信，而且经常被忽视。 8 月份，首个基于环状 RNA 的药物人体试验启动。但环状 RNA 距离引发药物研发革命，或实现拉隆德在本世纪末开发 100 种基于环状 RNA 的新药项目的承诺，还有很长的路要走。环状 RNA 的优势是否会使其优于其他持久疗法（如传统基因疗法）以及新兴的基因编辑疗法，仍是正在进行的研究和科学探索的领域。 但亚历山大·韦塞尔霍夫特（Alexander Wesselhoeft）——2018 年论文的第一作者，开创了外源环状 RNA 在真核细胞中表达蛋白质的新应用，也是 Orna Therapeutics 的联合创始人——仍然看好环状 RNA。他现在是麻省总医院布莱根基因和细胞治疗研究所的 RNA 治疗主任。他认为，尽管线性 mRNA 疫苗取得了巨大成功，但环状 RNA 才是未来的发展方向，将成为 RNA 治疗技术的首选。